Un espectrofotómetro es uno de los instrumentos científicos que se encuentran comúnmente en muchos laboratorios de investigación e industriales. Los espectrofotómetros se utilizan para la investigación en laboratorios de física, biología molecular, química y bioquímica. Por lo general, el nombre se refiere a la espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis).
La energía de la luz depende de su longitud de onda, generalmente designada como lambda. Aunque el espectro electromagnético se extiende sobre un amplio rango de longitudes de onda, la mayoría de los laboratorios solo pueden medir una pequeña fracción de ellas. La espectroscopía UV-Vis mide entre 200 y 400 nanómetros (nm) para mediciones de luz UV, y hasta aproximadamente 750 nm en el espectro visible.
Para la espectroscopía UV-Vis, las muestras generalmente se contienen y se miden en pequeños recipientes llamados cubetas. Estos pueden ser de plástico si se usan en el espectro visible, pero deben ser de cuarzo o sílice fundida si se usan para mediciones UV. Hay algunas máquinas que pueden utilizar tubos de ensayo de vidrio.
La espectroscopía visible a menudo se usa industrialmente para la colorimetría. Usando este método, las muestras se miden a múltiples longitudes de onda de 400-700 nm y sus perfiles de absorbancia se comparan con un estándar. Esta técnica es utilizada frecuentemente por fabricantes de textiles y tintas. Otros usuarios comerciales de la espectroscopía UV-Vis incluyen laboratorios forenses e impresoras.
En la investigación biológica y química, las soluciones a menudo se cuantifican midiendo su grado de absorción de luz a una longitud de onda particular. Un valor llamado coeficiente de extinción se usa para calcular la concentración del compuesto. Por ejemplo, los laboratorios de biología molecular usan espectrofotómetros para medir las concentraciones de muestras de ADN o ARN. A veces tienen una máquina avanzada llamada espectrofotómetro NanoDrop ™ que utiliza una fracción de la cantidad de muestra en comparación con la utilizada por los espectrofotómetros tradicionales.
Para que la cuantificación sea válida, la muestra debe obedecer la Ley de Beer-Lambert. Esto requiere que la absorbancia sea directamente proporcional a la longitud del camino de la cubeta y la absorción del compuesto. Hay tablas de coeficientes de extinción disponibles para muchos, pero no todos, los compuestos.
Muchas reacciones químicas y enzimáticas cambian de color con el tiempo, y los espectrofotómetros son muy útiles para medir estos cambios. Por ejemplo, las enzimas de polifenol oxidasa que hacen que la fruta se dore por oxidación de las soluciones de compuestos fenólicos, cambiando las soluciones claras a las que están visiblemente coloreadas. Dichas reacciones pueden analizarse midiendo el aumento de la absorbancia a medida que cambia el color. Idealmente, la tasa de cambio será lineal, y uno puede calcular las tasas a partir de estos datos. Un espectrofotómetro más avanzado tendrá un soporte para cubetas con temperatura controlada para llevar a cabo las reacciones a una temperatura precisa ideal para la enzima.
Los laboratorios de biología microbiológica y molecular con frecuencia usan un espectrofotómetro para medir el crecimiento de cultivos de bacterias. Los experimentos de clonación de ADN a menudo se realizan en bacterias, y los investigadores necesitan medir la etapa de crecimiento del cultivo para saber cuándo llevar a cabo ciertos procedimientos. Miden la absorbancia, que se conoce como densidad óptica (OD), en un espectrofotómetro. Uno puede decir desde el DO si las bacterias se están dividiendo activamente o si están comenzando a morir.
Los espectrofotómetros usan una fuente de luz para iluminar una variedad de longitudes de onda a través de un monocromador. Este dispositivo luego transmite una banda estrecha de luz, y el espectrofotómetro compara la intensidad de la luz que pasa a través de la muestra con la que pasa a través de un compuesto de referencia. Por ejemplo, si un compuesto se disuelve en etanol, la referencia sería etanol. El resultado se muestra como el grado de absorbancia de la diferencia entre ellos. Esto indica la absorbancia del compuesto de muestra.
La razón de esta absorbancia es que tanto la luz ultravioleta como la visible tienen suficiente energía para excitar a los químicos a niveles de energía mayores. Esta excitación da como resultado una mayor longitud de onda, que es visible cuando la absorbancia se representa contra la longitud de onda. Las diferentes moléculas o compuestos inorgánicos absorben energía a diferentes longitudes de onda. Aquellos con la máxima absorción en el rango visible son vistos como coloreados por el ojo humano.
Las soluciones de compuestos pueden ser claras, pero absorben en el rango UV. Tales compuestos generalmente tienen dobles enlaces o anillos aromáticos. A veces hay uno o más picos detectables cuando el grado de absorción se representa frente a la longitud de onda. Si es así, esto puede ayudar en la identificación de algunos compuestos al comparar la forma de la gráfica con la de las gráficas de referencia conocidas.
Hay dos tipos de máquinas de espectrofotómetro UV-Vis, de haz simple y doble haz. Estos difieren en cómo miden la intensidad de la luz entre la referencia y la muestra de prueba. Las máquinas de doble haz miden la referencia y el compuesto de prueba simultáneamente, mientras que las máquinas de un solo haz miden antes y después de agregar el compuesto de prueba.